Dziękujemy za odwiedzenie strony www.chinacdoe.com.Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłość wsparcia, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Systemy typu laboratorium na chipie z funkcjami na miejscu oferują potencjał szybkiej i dokładnej diagnozy i są przydatne w warunkach o ograniczonych zasobach, gdzie nie jest dostępny sprzęt biomedyczny i przeszkoleni specjaliści.Jednakże stworzenie systemu testowania przyłóżkowego, który jednocześnie posiadałby wszystkie funkcje niezbędne do wielofunkcyjnego dozowania, uwalniania na żądanie, niezawodnego działania i długoterminowego przechowywania odczynników, pozostaje poważnym wyzwaniem.W tym miejscu opisujemy technologię mikroprzełączników uruchamianych dźwignią, która może manipulować płynami w dowolnym kierunku, zapewnia precyzyjną i proporcjonalną reakcję na przyłożone ciśnienie powietrza i pozostaje stabilna w przypadku nagłych ruchów i wibracji.W oparciu o tę technologię opisujemy również rozwój systemu reakcji łańcuchowej polimerazy, który integruje funkcje wprowadzania odczynników, mieszania i reakcji w jednym procesie, który zapewnia działanie „próbka w odpowiedzi – na zewnątrz” dla wszystkich klinicznych próbek z nosa od 18 pacjentów z Grypa i 18 indywidualnych kontroli, przy dobrej zgodności intensywności fluorescencji ze standardową reakcją łańcuchową polimerazy (współczynniki Pearsona > 0,9).W oparciu o tę technologię opisujemy również rozwój systemu reakcji łańcuchowej polimerazy, który integruje funkcje wprowadzania odczynników, mieszania i reakcji w jednym procesie, który zapewnia skuteczność „próbka w odpowiedzi – na zewnątrz” dla wszystkich klinicznych próbek z nosa od 18 pacjentów z grypą i 18 indywidualnymi kontrolami, przy dobrej zgodności intensywności fluorescencji ze standardową reakcją łańcuchową polimerazy (współczynniki Pearsona > 0,9).Основаясь на этой технологии, ыы также оszczegar ии вения реагентов, сешивания и реакции в оном процесе, что-обеспечивает инических образц tyle i 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии intenсивности флуоресценции со стандартной полимеразной sепно й реакцией (коэффициенты Пирсона> 0,9).W oparciu o tę technologię opisujemy również rozwój systemu reakcji łańcuchowej polimerazy, który łączy w sobie funkcje wstrzykiwania, mieszania i reagowania w jednym procesie, umożliwiając pobieranie próbki w odpowiedzi na zewnątrz dla wszystkich klinicznych próbek z nosa od 18 pacjentów chorych na grypę.i 18 indywidualnych kontroli, dobrze zgodnych ze standardową intensywnością fluorescencji reakcji łańcuchowej polimerazy (współczynniki Pearsona > 0,9).W oparciu o tę technologię opisujemy również rozwój systemu reakcji łańcuchowej polimerazy, który integruje funkcje wstrzykiwania, mieszania i reakcji odczynnika w celu analizy wszystkich klinicznych próbek z nosa z 18 próbek pochodzących od pacjentów. Grypa i 18 indywidualnych kontroli, intensywność fluorescencji dopasowana dobrze ze standardową reakcją łańcuchową polimerazy (współczynnik Pearsona > 0,9).Proponowana platforma gwarantuje niezawodną automatyzację analiz biomedycznych, a tym samym może przyspieszyć komercjalizację szeregu urządzeń do badań przyłóżkowych.
Pojawiające się choroby ludzkie, takie jak pandemia Covid-19 w 2020 r., która pochłonęła życie milionów ludzi, stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia na świecie i cywilizacji ludzkiej1.Wczesne, szybkie i dokładne wykrywanie chorób ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania rozprzestrzeniania się wirusa i poprawy wyników leczenia.Podstawowy ekosystem diagnostyczny oparty na scentralizowanych laboratoriach, w których próbki testowe są wysyłane do szpitali lub klinik diagnostycznych i prowadzone przez specjalistów, ogranicza obecnie dostęp prawie 5,8 miliarda ludzi na całym świecie, szczególnie tym żyjącym w środowiskach o ograniczonych zasobach.gdzie brakuje drogiego sprzętu biomedycznego i wykwalifikowanych specjalistów.klinicyści 2. Istnieje zatem pilna potrzeba opracowania niedrogiego i przyjaznego dla użytkownika systemu typu laboratorium na chipie z możliwością przeprowadzania testów w miejscu opieki (POCT), który mógłby zapewnić klinicystom aktualne informacje diagnostyczne umożliwiające podejmowanie świadomych decyzji diagnostycznych .i leczenie 3.
Wytyczne Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) stanowią, że idealny POCT powinien być niedrogi, przyjazny dla użytkownika (łatwy w obsłudze przy minimalnym przeszkoleniu), dokładny (unikać wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich), szybki i niezawodny (zapewniać dobrą powtarzalność) oraz dostarczalny (możliwy do długotrwałego przechowywania i łatwo dostępny dla użytkowników końcowych)4.Aby spełnić te wymagania, systemy POCT muszą zapewniać następujące funkcje: wszechstronne dozowanie w celu ograniczenia ręcznej interwencji, uwalnianie na żądanie w celu skalowania transportu odczynnika w celu uzyskania dokładnych wyników testów oraz niezawodne działanie odporne na wibracje otoczenia.Obecnie najczęściej stosowanym urządzeniem POCT jest pasek przepływu bocznego5,6 składający się z kilku warstw porowatych membran nitrocelulozowych, które wypychają do przodu bardzo małą ilość próbki, reagując ze wstępnie immobilizowanymi odczynnikami siłą kapilarną.Chociaż ich zaletą jest niski koszt, łatwość użycia i szybkie wyniki, urządzenia POCT oparte na paskach przepływowych można stosować wyłącznie do testów biologicznych (np. testów glukozy7,8 i testów ciążowych9,10) bez konieczności przeprowadzania analiz wieloetapowych.reakcje (np. ładowanie wielu odczynników, mieszanie, multipleksowanie).Ponadto siły napędowe kontrolujące ruch płynu (tj. siły kapilarne) nie zapewniają dobrej spójności, zwłaszcza pomiędzy partiami, co skutkuje słabą odtwarzalnością11 i sprawia, że boczne pasma przepływu są przede wszystkim przydatne do dobrej detekcji12,13.
Rozszerzone możliwości produkcyjne w mikro- i nanoskali stworzyły możliwości rozwoju mikroprzepływowych urządzeń POCT do pomiarów ilościowych14,15,16,17.Dostosowując właściwości interfejsu 18, 19 i geometrię kanałów 20, 21, 22, można kontrolować siłę kapilarną i natężenie przepływu tych urządzeń.Jednak ich niezawodność, szczególnie w przypadku cieczy silnie zwilżonych, pozostaje nie do zaakceptowania ze względu na niedokładności produkcyjne, wady materiałowe i wrażliwość na wibracje otoczenia.Ponadto, ponieważ na granicy faz ciecz-gaz powstaje przepływ kapilarny, nie można wprowadzić żadnego dodatkowego przepływu, szczególnie po wypełnieniu cieczy kanałem mikroprzepływowym.Dlatego w celu bardziej złożonej detekcji należy wykonać kilka etapów wstrzykiwania próbki24,25.
Wśród urządzeń mikroprzepływowych, odśrodkowe urządzenia mikroprzepływowe są obecnie jednym z najlepszych rozwiązań dla POCT26,27.Jego mechanizm napędowy ma tę zaletę, że siłę napędową można regulować poprzez regulację prędkości obrotowej.Wadą jest jednak to, że siła odśrodkowa jest zawsze skierowana w stronę zewnętrznej krawędzi urządzenia, co utrudnia realizację wieloetapowych reakcji wymaganych w bardziej złożonych analizach.Chociaż w celu wielofunkcyjnego dozowania wprowadza się dodatkowe siły napędowe (np. kapilary 28, 29 i wiele innych 30, 31, 32, 33, 34, 35) oprócz siły odśrodkowej, w dalszym ciągu może wystąpić nieprzewidziany transfer cieczy, ponieważ te dodatkowe siły są zazwyczaj rzędu o wielkości mniejszej niż siła odśrodkowa, co czyni je skutecznymi jedynie w małych zakresach roboczych lub niedostępnymi na żądanie z uwalnianiem cieczy.Włączenie manipulacji pneumatycznych do mikroprzepływów odśrodkowych, takich jak odśrodkowe metody kinetyczne 36, 37, 38, metody termopneumatyczne 39 i aktywne metody pneumatyczne 40, okazało się atrakcyjną alternatywą.Przy podejściu kontrfugodynamicznym w urządzeniu zintegrowana jest dodatkowa wnęka i łączące je mikrokanały do działania zarówno zewnętrznego, jak i wewnętrznego, chociaż jego wydajność pompowania (w zakresie od 75% do 90%) jest w dużym stopniu zależna od liczby cykli pompowania i lepkości cieczy.W metodzie termopneumatycznej membrana lateksowa i komora przenoszenia płynu są specjalnie zaprojektowane tak, aby uszczelniać lub ponownie otwierać wlot, gdy uwięziona objętość powietrza zostanie ogrzana lub schłodzona.Jednakże konfiguracja ogrzewania/chłodzenia stwarza problemy z powolną reakcją i ogranicza jej zastosowanie w testach termoczułych (np. amplifikacja reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).Dzięki aktywnemu podejściu pneumatycznemu zwalnianie na żądanie i ruch do wewnątrz osiąga się poprzez jednoczesne przyłożenie nadciśnienia i precyzyjnie dopasowanych prędkości obrotowych przez silniki o dużej prędkości.Istnieją inne skuteczne podejścia wykorzystujące wyłącznie siłowniki pneumatyczne (nadciśnienie 41, 42 lub podciśnienie 43) i konstrukcje zaworów normalnie zamkniętych.Poprzez sukcesywne wywieranie ciśnienia w komorze pneumatycznej, ciecz jest pompowana perystaltycznie do przodu, a normalnie zamknięty zawór zapobiega cofaniu się cieczy na skutek perystaltyki, realizując w ten sposób złożone operacje cieczy.Jednakże obecnie istnieje tylko ograniczona liczba technologii mikroprzepływowych, które mogą wykonywać złożone operacje na cieczach w jednym urządzeniu POCT, w tym wielofunkcyjne dozowanie, uwalnianie na żądanie, niezawodne działanie, długotrwałe przechowywanie, obsługa cieczy o dużej lepkości, i opłacalna produkcja.Wszystko w tym samym czasie.Brak wieloetapowego działania funkcjonalnego może być również jednym z powodów, dla których dotychczas tylko kilka komercyjnych produktów POCT, takich jak Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat i Rhonda, zostało dotychczas z sukcesem wprowadzonych na otwarty rynek.
W tym artykule proponujemy pneumatyczny siłownik mikroprzepływowy oparty na technologii mikroprzełącznika z zielonym pierścieniem (FAST).FAST łączy w sobie wszystkie niezbędne właściwości jednocześnie dla szerokiej gamy odczynników od mikrolitrów po mililitry.FAST składa się z elastycznych membran, dźwigni i bloków.Bez zastosowania ciśnienia powietrza membrany, dźwignie i bloki można szczelnie zamknąć, a ciecz w środku może być przechowywana przez długi czas.Po przyłożeniu odpowiedniego ciśnienia i dopasowaniu go do długości dźwigni, membrana rozszerza się i przesuwa dźwignię do pozycji otwartej, umożliwiając przepływ płynu.Umożliwia to wielofunkcyjne dozowanie cieczy w sposób kaskadowy, symultaniczny, sekwencyjny lub selektywny.
Opracowaliśmy system PCR wykorzystujący FAST do generowania wyników odpowiedzi w próbce do wykrywania wirusów grypy A i B (IAV i IBV).Osiągnęliśmy dolną granicę wykrywalności (LOD) wynoszącą 102 kopie/ml, nasz test multipleksowy wykazał specyficzność dla IAV i IBV oraz umożliwił patotypowanie wirusa grypy.Wyniki badań klinicznych z użyciem wymazu z nosa od 18 pacjentów i 18 zdrowych osób wykazują dobrą zgodność intensywności fluorescencji ze standardową metodą RT-PCR (współczynniki Pearsona > 0,9).Wyniki badań klinicznych z użyciem wymazu z nosa od 18 pacjentów i 18 zdrowych osób wykazują dobrą zgodność intensywności fluorescencji ze standardową metodą RT-PCR (współczynniki Pearsona > 0,9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа od 18 пациентов i 18 здоровых лиц показывают хорошее соответствие inтенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Wyniki badań klinicznych z użyciem wymazu z nosa od 18 pacjentów i 18 zdrowych osób wykazują dobrą zgodność pomiędzy intensywnością fluorescencji standardowej RT-PCR (współczynniki Pearsona > 0,9).0,9）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Резльтаты клинических испытаний с исползз образцов назальных мазазов о 18 пścić тетствие между интенсивностюю флуоресценции dziką> 0,9).Wyniki badań klinicznych z użyciem wymazów z nosa od 18 pacjentów i 18 zdrowych osób wykazały dobrą zgodność pomiędzy intensywnością fluorescencji a standardową metodą RT-PCR (współczynnik Pearsona > 0,9).Szacunkowy koszt materiałowy urządzenia FAST-POCT wynosi około 1 USD (tabela uzupełniająca 1) i można go dodatkowo obniżyć, stosując metody produkcji na dużą skalę (np. formowanie wtryskowe).W rzeczywistości urządzenia POCT oparte na FAST mają wszystkie niezbędne funkcje wymagane przez WHO i są kompatybilne z nowymi metodami badań biochemicznych, takimi jak cykle termiczne plazmy44, testy immunologiczne bez amplifikacji45 i testy funkcjonalizacji nanociał46, które stanowią szkielet systemów POCT.możliwość.
Na ryc.1a przedstawia budowę platformy FAST-POCT, która składa się z czterech komór cieczy: komory wstępnego przechowywania, komory mieszania, komory reakcyjnej i komory odpadowej.Kluczem do kontroli przepływu płynu jest konstrukcja FAST (składająca się z elastycznych membran, dźwigni i bloków) umieszczona w komorze wstępnego magazynowania i komorze mieszania.Jako metoda uruchamiana pneumatycznie, konstrukcja FAST zapewnia precyzyjną kontrolę przepływu płynu, w tym przełączanie stanu zamkniętego/otwartego, wszechstronne dozowanie, uwalnianie płynu na żądanie, niezawodne działanie (np. niewrażliwość na wibracje otoczenia) i długotrwałe przechowywanie.Platforma FAST-POCT składa się z czterech warstw: warstwy podkładowej, warstwy elastycznej folii, warstwy folii z tworzywa sztucznego i warstwy wierzchniej, jak pokazano w powiększeniu na ryc. 1b (pokazano również szczegółowo na rysunkach uzupełniających S1 i S2 ).Wszystkie kanały i komory transportu płynu (takie jak komory wstępnego przechowywania i komory reakcyjne) są osadzone w podłożach PLA (kwas polimlekowy) o grubości od 0,2 mm (najcieńsza część) do 5 mm.Elastyczny materiał foliowy to PDMS o grubości 300 µm, który łatwo rozszerza się pod wpływem ciśnienia powietrza ze względu na „cienką grubość” i niski moduł sprężystości (około 2,25 MPa47).Warstwa folii polietylenowej wykonana jest z politereftalanu etylenu (PET) o grubości 100 µm, co chroni elastyczną folię przed nadmiernym odkształceniem pod wpływem ciśnienia powietrza.Odpowiednio do komór, warstwa podłoża posiada dźwignie połączone z warstwą wierzchnią (wykonaną z PLA) za pomocą zawiasów w celu kontroli przepływu cieczy.Elastyczną folię przyklejono do warstwy podkładowej za pomocą dwustronnej taśmy klejącej (ARseal 90880) i przykryto folią z tworzywa sztucznego.Trzy warstwy zmontowano na podłożu, stosując konstrukcję zacisku T w warstwie wierzchniej.Zacisk T ma szczelinę pomiędzy dwiema nogami.Kiedy zacisk został włożony w rowek, obie nóżki lekko się zgięły, a następnie powróciły do swojego pierwotnego stanu i szczelnie związały pokrywę i podkładkę, gdy przechodziły przez rowek (rysunek uzupełniający S1).Następnie cztery warstwy są łączone za pomocą łączników.
Schematyczny diagram platformy ilustrujący różne przedziały funkcjonalne i cechy FAST.b Powiększony schemat platformy FAST-POCT.c Zdjęcie platformy obok monety ćwierćdolarowej.
Mechanizm roboczy platformy FAST-POCT pokazano na rysunku 2. Kluczowymi elementami są bloki na warstwie bazowej i zawiasy na warstwie wierzchniej, co skutkuje projektem interferencyjnym przy montażu czterech warstw w kształcie litery T .Gdy nie działa ciśnienie powietrza (rys. 2a), pasowanie wciskowe powoduje zgięcie i odkształcenie zawiasu, a poprzez dźwignię przykładana jest siła uszczelniająca, która dociska elastyczną folię do bloku, i określa się zawartość cieczy w zagłębieniu uszczelki jako stan zamknięty.Należy zaznaczyć, że w tym stanie dźwignia jest wygięta na zewnątrz, jak pokazano w widoku z boku na rys. 2a.Po dostarczeniu powietrza (rys. 2b) elastyczna membrana rozszerza się na zewnątrz w kierunku pokrywy i popycha dźwignię do góry, otwierając w ten sposób szczelinę pomiędzy dźwignią a blokiem, umożliwiając przepływ płynu do następnej komory, co definiuje się jako stan otwarty .Po zwolnieniu ciśnienia powietrza dźwignia może powrócić do pierwotnego położenia i pozostać napięta dzięki elastyczności zawiasu.Filmy przedstawiające ruchy dźwigni przedstawiono w filmie uzupełniającym S1.
A. Schemat i fotografie po zamknięciu.W przypadku braku ciśnienia dźwignia dociska membranę do bloku, a ciecz zostaje uszczelniona.bW dobrym stanie.Po przyłożeniu ciśnienia membrana rozszerza się i popycha dźwignię do góry, dzięki czemu kanał otwiera się i płyn może przepływać.c Określ charakterystyczną wielkość ciśnienia krytycznego.Charakterystyczne wymiary obejmują długość dźwigni (L), odległość suwaka od zawiasu (l) oraz grubość występu dźwigni (t).Fs to siła zagęszczania w punkcie przepustnicy B. q to równomiernie rozłożone obciążenie dźwigni.Tx* reprezentuje moment obrotowy wytwarzany przez dźwignię przegubową.Ciśnienie krytyczne to ciśnienie wymagane do podniesienia dźwigni i umożliwienia przepływu płynu.d Teoretyczne i eksperymentalne wyniki zależności pomiędzy ciśnieniem krytycznym a rozmiarem elementu.Przeprowadzono n = 6 niezależnych eksperymentów, a dane przedstawiono jako ± odchylenie standardowe.Surowe dane są prezentowane jako surowe pliki danych.
Opracowano model analityczny oparty na teorii belki w celu analizy zależności ciśnienia krytycznego Pc, przy którym szczelina otwiera się, od parametrów geometrycznych (przykładowo L to długość dźwigni, l to odległość bloku od zawias, S to dźwignia. Powierzchnia styku z cieczą t to grubość występu dźwigni, jak pokazano na rys. 2c).Jak szczegółowo opisano w uwagach uzupełniających i rysunku dodatkowym S3, szczelina otwiera się, gdy \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), gdzie Fs jest momentem obrotowym \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\), aby wyeliminować siły związane z pasowaniem wciskowym i spowodować wygięcie zawiasu.Odpowiedź eksperymentalna i model analityczny wykazują dobrą zgodność (rys. 2d), pokazując, że ciśnienie krytyczne Pc rośnie wraz ze wzrostem t/l i spadkiem L, co można łatwo wytłumaczyć klasycznym modelem belki, tj. moment obrotowy rośnie wraz z t /Lift .Zatem nasza analiza teoretyczna wyraźnie pokazuje, że ciśnienie krytyczne można skutecznie kontrolować poprzez regulację długości dźwigni L i stosunku t/l, co stanowi ważną podstawę do projektowania platformy FAST-POCT.
Platforma FAST-POCT zapewnia wielofunkcyjne dozowanie (pokazane na rysunku 3a z wkładką i eksperymentem), co jest najważniejszą cechą udanego POCT, w którym płyny mogą przepływać w dowolnym kierunku i w dowolnej kolejności (kaskadowe, jednoczesne, sekwencyjne) lub selektywnie wielokanałowe dozowanie.– funkcja dozowania.Na ryc.3a(i) przedstawia tryb dozowania kaskadowego, w którym dwie lub więcej komór jest połączonych kaskadowo przy użyciu bloków do oddzielania różnych reagentów oraz dźwigni do kontrolowania stanu otwartego i zamkniętego.Po przyłożeniu ciśnienia ciecz przepływa kaskadowo z górnej do dolnej komory.Należy zaznaczyć, że komory kaskadowe można napełniać chemikaliami mokrymi lub suchymi np. proszkami liofilizowanymi.W eksperymencie pokazanym na rys. 3a(i) czerwony atrament z górnej komory przepływa wraz z niebieskim proszkiem barwnika (siarczanem miedzi) do drugiej komory i po dotarciu do dolnej komory zmienia kolor na ciemnoniebieski.Pokazuje także ciśnienie sterujące pompowanej cieczy.Podobnie, gdy jedna dźwignia jest podłączona do dwóch komór, następuje tryb wtrysku jednoczesnego, jak pokazano na rys.3a(ii), w którym ciecz może być równomiernie rozłożona w dwóch lub więcej komorach po przyłożeniu ciśnienia.Ponieważ ciśnienie krytyczne zależy od długości dźwigni, długość dźwigni można regulować w celu uzyskania sekwencyjnego wzorca wtrysku, jak pokazano na rys.3a(iii).Długą dźwignię (o ciśnieniu krytycznym Pc_long) podłączono do komory B, a krótką dźwignię (o ciśnieniu krytycznym Pc_short > Pc_long) podłączono do komory A. Po przyłożeniu ciśnienia P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) pojawiała się tylko ciecz w kolorze czerwonym może przepłynąć do komory B, a gdy ciśnienie wzrosnie do P2 (> Pc_short), niebieska ciecz może przepłynąć do komory A. Ten tryb wtrysku sekwencyjnego dotyczy różnych cieczy przesyłanych sekwencyjnie do powiązanych z nimi komór, co ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia POCT urządzenie.Długą dźwignię (o ciśnieniu krytycznym Pc_long) podłączono do komory B, a krótką dźwignię (o ciśnieniu krytycznym Pc_short > Pc_long) podłączono do komory A. Po przyłożeniu ciśnienia P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) pojawiała się tylko ciecz w kolorze czerwonym może przepłynąć do komory B, a gdy ciśnienie wzrosnie do P2 (> Pc_short), niebieska ciecz może przepłynąć do komory A. Ten tryb wtrysku sekwencyjnego dotyczy różnych cieczy przesyłanych sekwencyjnie do powiązanych z nimi komór, co ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia POCT urządzenie.Длинный ычычаг (с критическим давлением PC_LONG) ыы сеaR камерой а акort> PC оединен самерой A. fotra łatra приложении давлениala P1 (pc_long
a Ilustracja przydziału wielofunkcyjnego, tj. (i) kaskadowego, (ii) jednoczesnego, (iii) sekwencyjnego i (iv) przydziału selektywnego.Krzywe reprezentują przepływ pracy i parametry tych czterech trybów dystrybucji.b Wyniki badań długotrwałego przechowywania w wodzie dejonizowanej i etanolu.n = przeprowadzono 5 niezależnych eksperymentów, a dane przedstawiono jako ± sd c.Demonstracje testów stabilności, gdy urządzenie FAST i urządzenie z zaworem kapilarnym (CV) znajdowały się w stanie (i) statycznym i (ii) wibracyjnym.(iii) Objętość w funkcji czasu dla urządzeń FAST i CV przy różnych częstotliwościach kątowych.d Publikacja wyników testów na żądanie dla (i) urządzenia FAST i (ii) urządzenia CV.(iii) Zależność między objętością i czasem dla urządzeń FAST i CV wykorzystujących tryb przerywanego ciśnienia.Wszystkie podziałki 1 cm.Surowe dane są dostarczane jako surowe pliki danych.
Długoterminowe przechowywanie odczynników to kolejna ważna cecha udanego urządzenia POCT, która umożliwi nieprzeszkolonemu personelowi obsługę wielu odczynników.Chociaż wiele technologii wykazało swój potencjał w zakresie długotrwałego przechowywania (np. 35 mikrodozowników, 48 opakowań blistrowych i 49 opakowań typu stick), do pomieszczenia opakowania wymagana jest wydzielona komora odbiorcza, co zwiększa koszty i złożoność;ponadto te mechanizmy przechowywania nie pozwalają na dozowanie na żądanie i powodują marnowanie odczynników z powodu resztek w opakowaniu.Zdolność do długotrwałego przechowywania sprawdzono, przeprowadzając przyspieszony test żywotności przy użyciu obrabianego CNC materiału PMMA ze względu na jego niewielką chropowatość i odporność na przenikanie gazu (rysunek uzupełniający S5).Aparatura testowa została napełniona wodą dejonizowaną (woda dejonizowana) i 70% etanolem (symulującym odczynniki lotne) w temperaturze 65°C przez 9 dni.Zarówno wodę dejonizowaną, jak i etanol przechowywano przy użyciu folii aluminiowej, aby zablokować dostęp od góry.Do obliczenia ekwiwalentu w czasie rzeczywistym wykorzystano równanie Arrheniusa i energię aktywacji penetracji podaną w literaturze50,51.Na ryc.3b przedstawia średnie wyniki utraty masy dla 5 próbek przechowywanych w temperaturze 65°C przez 9 dni, co odpowiada 0,30% dla wody dejonizowanej i 0,72% dla 70% etanolu przez 2 lata w temperaturze 23°C.
Na ryc.3c przedstawia test wibracyjny.Ponieważ zawór kapilarny (CV) jest najpopularniejszą metodą transportu płynów wśród istniejących urządzeń POCT28,29, do porównania wykorzystano urządzenie CV o szerokości 300 µm i głębokości 200 µm.Można zauważyć, że gdy oba urządzenia pozostają nieruchome, płyn w platformie FAST-POCT uszczelnia się, a płyn w urządzeniu CV blokuje się na skutek nagłego rozszerzenia kanału, co zmniejsza siły kapilarne.Jednakże wraz ze wzrostem częstotliwości kątowej wibratora orbitalnego płyn w platformie FAST-POCT pozostaje szczelny, ale płyn w urządzeniu CV przepływa do dolnej komory (patrz także film uzupełniający S3).Sugeruje to, że odkształcalne zawiasy platformy FAST-POCT mogą wywierać na moduł dużą siłę mechaniczną, aby szczelnie zamknąć ciecz w komorze.Jednakże w urządzeniach CV ciecz jest zatrzymywana ze względu na równowagę pomiędzy fazą stałą, powietrzem i cieczą, co powoduje niestabilność, a wibracje mogą zaburzyć równowagę i spowodować nieoczekiwane zachowanie przepływu.Zaletą platformy FAST-POCT jest to, że zapewnia niezawodną funkcjonalność i pozwala uniknąć awarii w obecności wibracji, które zwykle występują podczas dostawy i eksploatacji.
Kolejną ważną cechą platformy FAST-POCT jest jej udostępnianie na żądanie, co jest kluczowym wymogiem w przypadku analiz ilościowych.Na ryc.3d porównuje wersję na żądanie platformy FAST-POCT i urządzenia CV.Z rys.3d(iii) widzimy, że urządzenie FAST szybko reaguje na sygnał ciśnienia.Po przyłożeniu ciśnienia do platformy FAST-POCT płyn zaczął płynąć, po zwolnieniu ciśnienia przepływ natychmiast ustał (ryc. 3d(i)).Działanie to można wytłumaczyć szybkim, elastycznym powrotem zawiasu, który dociska dźwignię z powrotem do bloku, zamykając komorę.Jednakże płyn nadal płynął w urządzeniu CV, co ostatecznie doprowadziło do nieoczekiwanej objętości płynu wynoszącej około 100 µl po zwolnieniu ciśnienia (rysunek 3d (ii) i film uzupełniający S4).Można to wytłumaczyć zanikiem efektu unieruchomienia naczyń włosowatych po całkowitym zwilżeniu CV po pierwszym wstrzyknięciu.
Możliwość obsługi cieczy o różnej zwilżalności i lepkości w tym samym urządzeniu pozostaje wyzwaniem w zastosowaniach POCT.Słaba zwilżalność może prowadzić do nieszczelności lub innych nieoczekiwanych zachowań związanych z przepływem w kanałach, a do przygotowania cieczy o dużej lepkości często wymagane są urządzenia pomocnicze, takie jak mieszadła wirowe, wirówki i filtry 52 .Zbadaliśmy związek pomiędzy ciśnieniem krytycznym a właściwościami płynu (przy szerokim zakresie zwilżalności i lepkości).Wyniki przedstawiono w Tabeli 1 i na filmie S5.Można zauważyć, że w komorze można uszczelnić ciecze o różnej zwilżalności i lepkości, a pod wpływem ciśnienia nawet ciecze o lepkości do 5500 cP mogą zostać przeniesione do sąsiedniej komory, dzięki czemu możliwa jest detekcja próbek o dużej lepkość (tj. plwocina, bardzo lepka próbka stosowana do diagnostyki chorób układu oddechowego).
Łącząc powyższe wielofunkcyjne urządzenia dozujące, można opracować szeroką gamę urządzeń POCT opartych na technologii FAST.Przykład pokazano na rysunku 1. Instalacja zawiera komorę wstępnego przechowywania, komorę mieszania, komorę reakcyjną i komorę odpadową.Odczynniki mogą być przechowywane w komorze wstępnego przechowywania przez dłuższy czas, a następnie wyładowywane do komory mieszania.Przy odpowiednim ciśnieniu zmieszane reagenty można selektywnie przenieść do komory odpadowej lub komory reakcyjnej.
Ponieważ wykrywanie PCR jest złotym standardem w wykrywaniu patogenów, takich jak H1N1 i COVID-19 i obejmuje wiele etapów reakcji, jako aplikację wykorzystaliśmy platformę FAST-POCT do wykrywania PCR.Na ryc.4 przedstawia proces badania PCR z wykorzystaniem platformy FAST-POCT.Najpierw odczynnik eluujący, odczynnik w postaci mikrokulek magnetycznych, roztwór do płukania A i roztwór do płukania W przepipetowano odpowiednio do komór wstępnego przechowywania E, M, W1 i W2.Etapy adsorpcji RNA pokazano na ryc.4a i są następujące: (1) po przyłożeniu ciśnienia P1 (=0,26 bar) próbka przemieszcza się do komory M i jest odprowadzana do komory mieszania.(2) Ciśnienie powietrza P2 (= 0,12 bar) jest dostarczane przez przyłącze A podłączone do dolnej części komory mieszania.Chociaż wiele metod mieszania wykazało swój potencjał w mieszaniu cieczy na platformach POCT (np. mieszanie serpentynowe 53, mieszanie losowe 54 i mieszanie wsadowe 55), ich wydajność i skuteczność mieszania nadal nie jest zadowalająca.Przyjmuje metodę mieszania pęcherzykowego, w której powietrze jest wprowadzane na dno komory mieszania w celu wytworzenia pęcherzyków w cieczy, po czym silny wir może osiągnąć całkowite wymieszanie w ciągu kilku sekund.Przeprowadzono eksperymenty z mieszaniem pęcherzyków, a wyniki przedstawiono na rysunku uzupełniającym S6.Można zauważyć, że przy ciśnieniu 0,10 bara całkowite wymieszanie zajmuje około 8 sekund.Zwiększając ciśnienie do 0,20 bara, całkowite wymieszanie osiąga się w ciągu około 2 sekund.Metody obliczania wydajności mieszania przedstawiono w rozdziale Metody.(3) Użyj magnesu rubidowego, aby wyodrębnić kulki, następnie zwiększ ciśnienie P3 (= 0,17 bar) przez port P, aby przenieść odczynniki do komory na odpady.Na ryc.4b,c przedstawia etapy przemywania mające na celu usunięcie zanieczyszczeń z próbki w następujący sposób: (1) Roztwór płuczący A z komory W1 jest odprowadzany do ciśnieniowej komory mieszania P1.(2) Następnie wykonaj proces mieszania bąbelków.(3) Roztwór myjący A jest przenoszony do komory cieczy odpadowej, a mikrokulki w komorze mieszania są wyciągane przez magnes.Pranie W (ryc. 4c) przebiegało podobnie do prania A (ryc. 4b).Należy zauważyć, że każdy etap przemywania A i W przeprowadzono dwukrotnie.Figura 4d przedstawia etapy elucji RNA z kulek;etapy elucji i mieszania, wprowadzenie są takie same, jak etapy adsorpcji i przemywania RNA opisane powyżej.Gdy odczynniki eluujące są przenoszone do komory reakcyjnej PCR pod ciśnieniami P3 i P4 (=0,23 bar), osiągane jest ciśnienie krytyczne, aby uszczelnić ramię komory reakcyjnej PCR.Podobnie ciśnienie P4 pomaga również uszczelnić przejście do komory odpadów.Zatem wszystkie odczynniki eluujące zostały równomiernie rozmieszczone w czterech komorach reakcyjnych PCR, aby zainicjować reakcje multipleksowej PCR.Powyższa procedura została przedstawiona w filmie uzupełniającym S6.
W etapie adsorpcji RNA próbkę wprowadza się do wlotu M i wtryskuje do komory mieszania wraz z wcześniej przechowywanym roztworem perełek.Po wymieszaniu i usunięciu granulatu odczynniki rozprowadzane są do komory na odpady.b i c etapów przemywania, wprowadzić różne wstępnie przechowywane odczynniki myjące do komory mieszania, a po wymieszaniu i usunięciu kulek przenieść odczynniki do komory na ciecz odpadową.d Etap elucji: Po wprowadzeniu odczynników eluujących, wymieszaniu i ekstrakcji kulek, odczynniki przenosi się do komory reakcyjnej PCR.Krzywe przedstawiają przepływ pracy i powiązane parametry na różnych etapach.Ciśnienie to ciśnienie wywierane przez poszczególne komory.Objętość to objętość cieczy w komorze mieszania.Wszystkie słupki skali mają 1 cm.Surowe dane są dostarczane jako surowe pliki danych.
Przeprowadzono procedurę testową PCR, a rysunek uzupełniający S7 przedstawia profile termiczne, w tym 20 minut czasu odwrotnej transkrypcji i 60 minut czasu cyklu termicznego (95 i 60 ° C), przy czym jeden cykl termiczny trwa 90 s (film uzupełniający S7)..FAST-POCT wymaga mniej czasu na ukończenie jednego cyklu termicznego (90 sekund) niż konwencjonalny RT-PCR (180 sekund na jeden cykl termiczny).Można to wytłumaczyć wysokim stosunkiem powierzchni do objętości i niską bezwładnością cieplną komory reakcyjnej mikro-PCR.Powierzchnia komory wynosi 96,6 mm2, a objętość komory 25 mm3, co daje stosunek powierzchni do objętości w przybliżeniu 3,86.Jak widać na rysunku dodatkowym S10, obszar testowy PCR naszej platformy ma rowek na tylnym panelu, dzięki czemu dno komory PCR ma grubość 200 µm.Do powierzchni grzewczej regulatora temperatury przymocowana jest termoprzewodząca elastyczna podkładka, zapewniająca szczelny kontakt z tylną częścią pudełka testowego.Zmniejsza to bezwładność cieplną platformy i poprawia wydajność ogrzewania/chłodzenia.Podczas cykli termicznych parafina osadzona w platformie topi się i wpływa do komory reakcyjnej PCR, działając jako uszczelniacz zapobiegający parowaniu odczynnika i zanieczyszczeniu środowiska (patrz film uzupełniający S8).
Wszystkie opisane powyżej procesy wykrywania PCR zostały w pełni zautomatyzowane przy użyciu wykonanego na zamówienie instrumentu FAST-POCT, składającego się z programowanej jednostki kontroli ciśnienia, jednostki do ekstrakcji magnetycznej, jednostki kontroli temperatury oraz jednostki do przechwytywania i przetwarzania sygnału fluorescencyjnego.Warto zauważyć, że do izolacji RNA wykorzystaliśmy platformę FAST-POCT, a następnie wyekstrahowane próbki RNA wykorzystaliśmy do reakcji PCR, stosując dla porównania system FAST-POCT i stacjonarny system PCR.Wyniki były prawie takie same, jak pokazano na rysunku dodatkowym S8.Operator wykonuje proste zadanie: wprowadza próbkę do komory M i umieszcza platformę w przyrządzie.Ilościowe wyniki badań są dostępne w ciągu około 82 minut.Szczegółowe informacje na temat narzędzi FAST-POCT znajdują się na rysunku uzupełniającym.C9, C10 i C11.
Grypa wywoływana przez wirusy grypy A (IAV), B (IBV), C (ICV) i D (IDV) jest powszechnym zjawiskiem ogólnoświatowym.Spośród nich IAV i IBV są odpowiedzialne za najcięższe przypadki i epidemie sezonowe, zakażając 5–15% światowej populacji, powodując 3–5 milionów ciężkich przypadków i powodując 290 000–650 000 zgonów rocznie.Choroby układu oddechowego56,57.Wczesne rozpoznanie IAV i IB jest niezbędne, aby zmniejszyć zachorowalność i związane z nią obciążenie ekonomiczne.Spośród dostępnych technik diagnostycznych reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) uważa się za najbardziej czułą, swoistą i dokładną (>99%)58,59.Spośród dostępnych technik diagnostycznych reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) uważa się za najbardziej czułą, swoistą i dokładną (>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) считается наиболее чувствительной, специфичной и точной (> 99%)58,59.Spośród dostępnych metod diagnostycznych za najbardziej czułą, swoistą i dokładną (> 99%) uważa się reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR)58,59. Из доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) с читается наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%)58,59.Spośród dostępnych metod diagnostycznych za najbardziej czułą, specyficzną i dokładną (>99%) uważa się reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR).Jednakże tradycyjne metody RT-PCR wymagają wielokrotnego pipetowania, mieszania, dozowania i przenoszenia płynu, co ogranicza ich użycie przez profesjonalistów w warunkach o ograniczonych zasobach.W tym przypadku platformę FAST-POCT wykorzystano do wykrywania PCR odpowiednio IAV i IBV w celu uzyskania ich dolnej granicy wykrywalności (LOD).Ponadto IAV i IBV zostały zmultipleksowane, aby rozróżnić różne patotypy u różnych gatunków, zapewniając obiecującą platformę do analizy genetycznej i możliwości dokładnego leczenia choroby.
Na ryc.5a przedstawia wyniki testu PCR HAV przy użyciu 150 µl oczyszczonego wirusowego RNA jako próbki.Na ryc.5a(i) pokazuje, że przy stężeniu HAV wynoszącym 106 kopii/ml intensywność fluorescencji (ΔRn) może osiągnąć 0,830, a gdy stężenie zostanie zmniejszone do 102 kopii/ml, ΔRn może nadal osiągnąć 0,365, co odpowiada wartości wyższej pustej grupy kontroli negatywnej (0,002), około 100 razy wyższa.Do oceny ilościowej w oparciu o sześć niezależnych eksperymentów wygenerowano liniową krzywą kalibracji pomiędzy stężeniem logarytmicznym a progiem cyklu (Ct) IAV (ryc. 5a (ii)), R2 = 0, 993, w zakresie od 102-106 kopii/ml.wyniki są w dobrej zgodności z konwencjonalnymi metodami RT-PCR.Na ryc.5a(iii) przedstawia obrazy fluorescencyjne wyników testu po 40 cyklach platformy FAST-POCT.Odkryliśmy, że platforma FAST-POCT może wykryć HAV już w ilości 102 kopii/ml.Jednakże w przypadku tradycyjnej metody wartość Ct nie wynosi 102 kopii/ml, co oznacza, że LOD wynosi około 103 kopii/ml.Postawiliśmy hipotezę, że może to wynikać z wysokiej wydajności mieszania pęcherzyków.Przeprowadzono eksperymenty testowe PCR na oczyszczonym RNA IAV w celu oceny różnych metod mieszania, w tym mieszania z wytrząsaniem (ta sama metoda mieszania, co w konwencjonalnej operacji RT-PCR), mieszania w fiolce (ta metoda, 3 s przy 0,12 bara) i braku mieszania jako grupa kontrolna ..Wyniki można znaleźć na rysunku dodatkowym S12.Można zauważyć, że przy wyższym stężeniu RNA (106 kopii/ml) wartości Ct dla różnych metod mieszania są prawie takie same jak w przypadku mieszania pęcherzykowego.Kiedy stężenie RNA spadło do 102 kopii/ml, mieszanka wytrząsana i kontrole nie miały wartości Ct, podczas gdy metoda mieszania pęcherzykowego nadal dawała wartość Ct 36,9, która była poniżej progu Ct wynoszącego 38. Wyniki pokazują dominującą charakterystykę mieszania pęcherzyków, co wykazano również w innej literaturze, co może również wyjaśniać, dlaczego czułość platformy FAST-POCT jest nieco wyższa niż konwencjonalnej RT-PCR.Na ryc.5b przedstawia wyniki analizy PCR oczyszczonych próbek RNA IBV w zakresie od 101 do 106 kopii/ml.Wyniki były podobne do testu IAV, osiągając R2 = 0,994 i LOD 102 kopii/ml.
analizę PCR wirusa grypy A (IAV) przy stężeniach IAV w zakresie od 106 do 101 kopii/ml, stosując bufor TE jako kontrolę ujemną (NC).(i) Krzywa fluorescencji w czasie rzeczywistym.(ii) Liniowa krzywa kalibracji pomiędzy logarytmicznym stężeniem RNA IAV a progiem cyklu (Ct) dla FAST i konwencjonalnych metod testowania.(iii) Obraz fluorescencyjny IAV FAST-POCT po 40 cyklach.b, wykrywanie metodą PCR wirusa grypy B (IBV) za pomocą (i) widma fluorescencji w czasie rzeczywistym.(ii) Liniowa krzywa kalibracji i (iii) obraz fluorescencji FAST-POCT IBV po 40 cyklach.Dolna granica wykrywalności (LOD) dla IAV i IBV przy użyciu platformy FAST-POCT wynosiła 102 kopie/ml, czyli mniej niż w przypadku metod konwencjonalnych (103 kopie/ml).c Wyniki testów multipleksowych dla IAV i IBV.GAPDH zastosowano jako kontrolę pozytywną, a bufor TE zastosowano jako kontrolę negatywną, aby zapobiec możliwemu zanieczyszczeniu i amplifikacji tła.Można wyróżnić cztery różne typy próbek: (1) próbki ujemne zawierające wyłącznie GAPDH („IAV-/IBV-”);(2) zakażenie IAV („IAV+/IBV-”) IAV i GAPDH;(3) zakażenie IBV („IAV-/IBV+”) IBV i GAPDH;(4) Zakażenie IAV/IBV („IAV+/IBV+”) IAV, IBV i GAPDH.Linia przerywana oznacza linię progową.Przeprowadzono n = 6 biologicznie niezależnych eksperymentów, dane przedstawiono jako ± odchylenie standardowe.Surowe dane są prezentowane jako surowe pliki danych.
Na ryc.5c przedstawia wyniki testu multipleksowania dla IAV/IBV.Tutaj zamiast oczyszczonego RNA jako roztworu próbki zastosowano lizat wirusa, a do czterech różnych komór reakcyjnych platformy FAST-POCT dodano cztery startery dla IAV, IBV, GAPDH (kontrola pozytywna) i bufor TE (kontrola negatywna).Stosowane są tutaj kontrole pozytywne i negatywne, aby zapobiec możliwemu zanieczyszczeniu i wzmocnieniu tła.Testy podzielono na cztery grupy: (1) próbki ujemne pod względem GAPDH („IAV-/IBV-”);(2) zakażony IAV („IAV+/IBV-”) w porównaniu z IAV i GAPDH;(3) IBV-.zakażony („IAV-”) -/IBV+”) IBV i GAPDH;(4) Zakażenie IAV/IBV („IAV+/IBV+”) IAV, IBV i GAPDH.Na ryc.Fig. 5c pokazuje, że gdy zastosowano próbki ujemne, intensywność fluorescencji ΔRn komory kontroli pozytywnej wynosiła 0,860, a ΔRn IAV i IBV była podobna do kontroli negatywnej (0,002).W przypadku grup IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ i IAV+/IBV+ kamery IAV/GAPDH, IBV/GAPDH i IAV/IBV/GAPDH wykazały odpowiednio znaczną intensywność fluorescencji, podczas gdy inne kamery pokazywały nawet intensywność fluorescencji w tle poziom 40 po cyklu termicznym.Z powyższych testów wynika, że platforma FAST-POCT wykazała się wyjątkową specyficznością i umożliwiła jednoczesne patotypowanie różnych wirusów grypy.
Aby potwierdzić przydatność kliniczną testu FAST-POCT, przetestowaliśmy 36 próbek klinicznych (wymazy z nosa) od pacjentów z IB (n=18) i osób z grupy kontrolnej bez IB (n=18) (ryc. 6a).Informacje o pacjencie przedstawiono w tabeli uzupełniającej 3. Stan zakażenia IB został niezależnie potwierdzony, a protokół badania został zatwierdzony przez Pierwszy Szpital Stowarzyszony Uniwersytetu Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang).Każdą próbkę pacjentów podzielono na dwie kategorie.Jeden przetwarzano przy użyciu FAST-POCT, a drugi przy użyciu stacjonarnego systemu PCR (SLAN-96P, Chiny).W obu testach wykorzystuje się te same zestawy do oczyszczania i wykrywania.Na ryc.6b przedstawia wyniki FAST-POCT i konwencjonalnej PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR).Porównaliśmy intensywność fluorescencji (FAST-POCT) z -log2(Ct), gdzie Ct jest progiem cyklu dla konwencjonalnej RT-PCR.Obie metody wykazały dobrą zgodność.FAST-POCT i RT-PCR wykazały silną dodatnią korelację ze współczynnikiem Pearsona (r) wynoszącym 0, 90 (ryc. 6b).Następnie oceniliśmy dokładność diagnostyczną testu FAST-POCT.Rozkłady intensywności fluorescencji (FL) dla próbek dodatnich i ujemnych podano jako niezależną miarę analityczną (ryc. 6c).Wartości FL były istotnie wyższe u pacjentów z IB niż w grupie kontrolnej (****P = 3,31 × 10-19; dwustronny test t) (ryc. 6d).Następnie wykreślono krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika IBV (ROC).Stwierdziliśmy, że dokładność diagnostyczna była bardzo dobra, a pole pod krzywą wynosiło 1 (ryc. 6e).Należy pamiętać, że ze względu na obowiązkowe zamawianie masek w Chinach ze względu na COVID-19 od 2020 r. nie zidentyfikowaliśmy pacjentów z IBD, dlatego wszystkie pozytywne próbki kliniczne (tj. próbki wymazu z nosa) dotyczyły wyłącznie wirusa IBV.
Projekt badania klinicznego.Łącznie przeanalizowano 36 próbek, w tym 18 próbek od pacjentów i 18 kontroli innych niż grypa, przy użyciu platformy FAST-POCT i konwencjonalnej metody RT-PCR.b Ocenić spójność analityczną pomiędzy FAST-POCT PCR i konwencjonalną RT-PCR.Wyniki były ze sobą dodatnio skorelowane (r Pearsona = 0,90).c Poziomy intensywności fluorescencji u 18 pacjentów z IB i 18 kontroli.d U pacjentów z IB (+) wartości FL były istotnie wyższe niż w grupie kontrolnej (-) (****P = 3,31 × 10-19; dwustronny test t; n = 36).Dla każdego kwadratowego wykresu czarny znacznik pośrodku reprezentuje medianę, a dolna i górna linia prostokąta przedstawiają odpowiednio 25. i 75. percentyl.Wąsy rozciągają się na minimalne i maksymalne punkty danych, których nie uważa się za wartości odstające.e Krzywa ROC.Linia przerywana d przedstawia wartość progową oszacowaną na podstawie analizy ROC.AUC dla IBV wynosi 1. Surowe dane są dostarczane w postaci surowych plików danych.
W tym artykule przedstawiamy FAST, który posiada cechy wymagane dla idealnego POCT.Zaletami naszej technologii są: (1) wszechstronne dozowanie (kaskadowe, jednoczesne, sekwencyjne i selektywne), uwalnianie na żądanie (szybkie i proporcjonalne uwalnianie przyłożonego ciśnienia) oraz niezawodność działania (wibracje przy 150 stopniach) (2) długotrwałe przechowywanie (2 lata przyspieszonych testów, utrata masy ciała około 0,3%);(3) możliwość pracy z cieczami o szerokim zakresie zwilżalności i lepkości (lepkość do 5500 cP);(4) Ekonomiczne (szacunkowy koszt materiałowy urządzenia FAST-POCT PCR wynosi około 1 USD).Łącząc wielofunkcyjne dozowniki, zademonstrowano i zastosowano zintegrowaną platformę FAST-POCT do wykrywania metodą PCR wirusów grypy A i B.FAST-POCT zajmuje tylko 82 minuty.Testy kliniczne przeprowadzone na 36 próbkach wymazów z nosa wykazały dobrą zgodność intensywności fluorescencji ze standardową metodą RT-PCR (współczynniki Pearsona > 0,9).Testy kliniczne przeprowadzone na 36 próbkach wymazów z nosa wykazały dobrą zgodność intensywności fluorescencji ze standardową metodą RT-PCR (współczynniki Pearsona > 0,9).Клинические teсты z 36 образцами мазков i носа показали хорошее соответствие интенсивности флуоресценции stojaki ртной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Testy kliniczne przeprowadzone na 36 próbkach wymazów z nosa wykazały dobrą zgodność z intensywnością fluorescencji standardowego RT-PCR (współczynniki Pearsona > 0,9).RT-PCR Клинические испытания 36 образцов мазков из носа показали хорошее совпадение inтенсивности флуоресценции с о стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Badania kliniczne 36 próbek wymazów z nosa wykazały dobrą zgodność intensywności fluorescencji ze standardową metodą RT-PCR (współczynnik Pearsona > 0,9).Równolegle z tymi pracami różne pojawiające się metody biochemiczne (np. cykle termiczne plazmy, testy immunologiczne bez amplifikacji i testy funkcjonalizacji nanociała) wykazały swój potencjał w POCT.Jednakże ze względu na brak w pełni zintegrowanej i solidnej platformy POCT metody te nieuchronnie wymagają oddzielnych procedur wstępnego przetwarzania (np. izolacji RNA44, inkubacji45 i przemywania46), co dodatkowo uzupełnia obecne prace nad tymi metodami w celu wdrożenia zaawansowanych funkcji POCT z wymagane parametry.wydajność pobierania w odpowiedzi.W tej pracy, chociaż pompa powietrza używana do aktywacji zaworu FAST jest na tyle mała, że można ją zintegrować z przyrządem laboratoryjnym (rys. S9, S10), nadal zużywa znaczną energię i generuje hałas.Zasadniczo pompy pneumatyczne o mniejszych rozmiarach można zastąpić innymi sposobami, takimi jak użycie siły elektromagnetycznej lub uruchomienie palcem.Dalsze ulepszenia mogą obejmować na przykład dostosowanie zestawów do różnych i specyficznych testów biochemicznych, wykorzystanie nowych metod wykrywania, które nie wymagają systemów ogrzewania/chłodzenia, zapewniając w ten sposób niewymagającą narzędzi platformę POCT do zastosowań PCR.Wierzymy, że biorąc pod uwagę, że platforma FAST umożliwia manipulowanie płynami, wierzymy, że proponowana technologia FAST stwarza potencjał do stworzenia wspólnej platformy nie tylko do badań biomedycznych, ale także do monitorowania środowiska, badania jakości żywności, syntezy materiałów i leków ..
Pobieranie i wykorzystywanie próbek wymazów z nosa ludzkiego zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Zhejiang (IIT20220330B).Pobrano 36 wymazów z nosa od 16 osób dorosłych do 30. roku życia, 7 osób powyżej 40. roku życia oraz 19 mężczyzn i 17 kobiet.Pobrano 36 wymazów z nosa od 16 osób dorosłych do 30. roku życia, 7 osób powyżej 40. roku życia oraz 19 mężczyzn i 17 kobiet.Было собрано 36 образцов мазков из носа, в которых приняли участие 16 взрослых < 30 lat, 7 gwiazdek 40 lat, 19 miesięcy i 17 dni.Pobrano trzydzieści sześć wymazów z nosa od 16 osób dorosłych w wieku poniżej 30 lat, 7 osób dorosłych w wieku powyżej 40 lat, 19 mężczyzn i 17 kobiet.Dane demograficzne przedstawiono w tabeli uzupełniającej 3. Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę.U wszystkich uczestników podejrzewano grypę i poddano je dobrowolnym testom bez odszkodowania.
Podstawa i pokrywa FAST wykonane są z kwasu polimlekowego (PLA) i wydrukowane na drukarce 3D Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Taśmę dwustronną zakupiono od Klejów Research, Inc. Model 90880. Folię PET o grubości 100 µm zakupiono od McMaster-Carr.Zarówno klej, jak i folię PET wycięto przy użyciu przecinarki Silhouette Cameo 2 firmy Silhouette America, Inc. Elastyczna folia jest wykonana z materiału PDMS metodą formowania wtryskowego.Najpierw wycięto ramkę PET o grubości 200 µm za pomocą systemu laserowego i przyklejono ją do arkusza PMMA o grubości 3 mm za pomocą dwustronnej taśmy klejącej o grubości 100 µm.Następnie do formy wlano prekursor PDMS (Sylgard 184; Część A: Część B = 10:1, Dow Corning) i za pomocą szklanego pręta usunięto nadmiar PDMS.Po utwardzaniu w temperaturze 70°C przez 3 godziny, folię PDMS o grubości 300 µm można było zdjąć z formy.
Zdjęcia umożliwiające wszechstronną dystrybucję, publikację na żądanie i niezawodne działanie wykonywane są za pomocą szybkiego aparatu (Sony AX700 1000 kl./s).Wytrząsarka orbitalna zastosowana w teście niezawodności została zakupiona w firmie SCILOGEX (SCI-O180).Ciśnienie powietrza jest generowane przez sprężarkę powietrza, a do regulacji wartości ciśnienia służy kilka cyfrowych precyzyjnych regulatorów ciśnienia.Proces testowania zachowania przepływu jest następujący.Do urządzenia testowego wstrzyknięto określoną ilość płynu, a do zarejestrowania zachowania przepływu wykorzystano szybką kamerę.Następnie pobrano zdjęcia z filmów przedstawiających zachowanie przepływu w ustalonych momentach, a pozostały obszar obliczono za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus, który następnie pomnożono przez głębokość kamery w celu obliczenia objętości.Szczegóły systemu testowania zachowania przepływu można znaleźć na rysunku uzupełniającym S4.
Wstrzyknąć 50 µl mikrokulek i 100 µl wody dejonizowanej do urządzenia mieszającego fiolki.Zdjęcia o różnym charakterze wykonywano szybkim aparatem co 0,1 sekundy przy ciśnieniach 0,1 bara, 0,15 bara i 0,2 bara.Informacje o pikselach podczas procesu mieszania można uzyskać z tych obrazów za pomocą oprogramowania do przetwarzania zdjęć (Photoshop CS6).Wydajność mieszania można osiągnąć za pomocą następującego równania 53.
gdzie M to wydajność mieszania, N to całkowita liczba pikseli próbki, a ci i \(\bar{c}\) to znormalizowane i oczekiwane znormalizowane stężenia.Wydajność mieszania waha się od 0 (0%, niezmieszany) do 1 (100%, całkowicie wymieszany).Wyniki pokazano na rysunku dodatkowym S6.
Zestaw do RT-PCR w czasie rzeczywistym dla IAV i IBV, zawierający próbki RNA IAV i IBV (nr kat. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Chiny), bufor Tris-EDTA (bufor TE nr B541019) , Sangon Biotech, Chiny), zestaw do oczyszczania RNA kontroli dodatniej (nr części Z-ME-0010, Liferiver, Chiny) i roztwór GAPDH (nr części M591101, Sangon Biotech, Chiny) są dostępne w handlu.Zestaw do oczyszczania RNA zawiera bufor wiążący, przemywanie A, przemywanie W, eluent, mikroperełki magnetyczne i nośnik akrylowy.Zestawy do RT-PCR w czasie rzeczywistym IAV i IBV obejmują mieszaninę do wykrywania kwasu nukleinowego IFVA i enzym RT-PCR.Dodać 6 µl AcrylCarrier i 20 µl kulek magnetycznych do 500 µl roztworu buforu wiążącego, dobrze wstrząsnąć, a następnie przygotować roztwór kulek.Do popłuczyn A i W dodać 21 ml etanolu, dobrze wstrząsnąć do otrzymania roztworów, odpowiednio popłuczyn A i W.Następnie 18 µl fluorescencyjnej mieszaniny PCR z kwasem nukleinowym IFVA i 1 µl enzymu RT-PCR dodano do 1 µl roztworu TE, wytrząsano i wirowano przez kilka sekund, uzyskując 20 µl starterów IAV i IBV.
Postępuj zgodnie z następującą procedurą oczyszczania RNA: (1) Adsorpcja RNA.Odpipetować 526 µl roztworu osadu do 1,5 ml probówki wirówkowej i dodać 150 µl próbki, następnie ręcznie wstrząsnąć probówką 10 razy w górę i w dół.Przenieść 676 µl mieszaniny na kolumnę powinowactwa i wirować przy 1,88 x 104 g przez 60 sekund.Kolejne dreny są następnie odrzucane.(2) Pierwszy etap mycia.Dodać 500 µl roztworu do płukania A do kolumny powinowactwa, wirować przy 1,88 x 104 g przez 40 s i odrzucić zużyty roztwór.Ten proces przemywania powtórzono dwukrotnie.(3) drugi etap mycia.Dodać 500 µl roztworu do płukania W do kolumny powinowactwa, wirować przy 1,88×104 g przez 15 s i odrzucić zużyty roztwór.Ten proces przemywania powtórzono dwukrotnie.(4) Elucja.Dodać 200 µl eluatu do kolumny powinowactwa i wirować przy 1,88 x 104 g przez 2 min.(5) RT-PCR: Eluat wstrzyknięto do 20 µl roztworu startera w probówce do PCR, następnie probówkę umieszczono w aparacie testowym do PCR w czasie rzeczywistym (SLAN-96P) w celu przeprowadzenia procesu RT-PCR.Cały proces wykrywania trwa około 140 minut (20 minut w przypadku oczyszczania RNA i 120 minut w przypadku detekcji PCR).
Wstępnie dodano 526 µl roztworu perełek, 1000 µl roztworu do płukania A, 1000 µl roztworu do płukania W, 200 µl eluatu i 20 µl roztworu startera i przechowywano w komorach M, W1, W2, E i komorach detekcji PCR.Montaż platformy.Następnie 150 µl próbki odpipetowano do komory M i platformę FAST-POCT włożono do przyrządu testowego pokazanego na rysunku uzupełniającym S9.Wyniki testu były dostępne po około 82 minutach.
O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie wyniki testu przedstawiono jako średnią ± SD po co najmniej sześciu powtórzeniach przy użyciu wyłącznie platformy FAST-POCT i biologicznie niezależnych próbek.Z analizy nie wyłączono żadnych danych.Eksperymenty nie są przypadkowe.Podczas eksperymentu badacze nie byli ślepi na zadania grupowe.
Więcej informacji na temat projektu badania można znaleźć w streszczeniu raportu z badań przyrodniczych, do którego link znajduje się w tym artykule.
Dane potwierdzające wyniki tego badania są dostępne w informacjach uzupełniających.W tym artykule przedstawiono oryginalne dane.
Chagla, Z. i Madhukar, P. Dodatki wzmacniające Covid-19 w bogatych krajach opóźnią wprowadzenie szczepionek dla wszystkich.Chagla, Z. i Madhukar, P. Dodatki wzmacniające Covid-19 w bogatych krajach opóźnią wprowadzenie szczepionek dla wszystkich.Chagla, Z. i Madhukar, P. Dopalacze przeciwko COVID-19 w bogatych krajach opóźnią wprowadzenie szczepionek dla wszystkich.Chagla, Z. i Madhukar, P. Ponowne szczepienie przeciwko Covid-19 w bogatych krajach opóźni szczepienie u wszystkich.Medycyna narodowa.27, 1659–1665 (2021).
Faust, L. i in.Testy na SARS-CoV-2 w krajach o niskich i średnich dochodach: dostępność i przystępność cenowa w sektorze prywatnej opieki zdrowotnej.infekcja mikrobiologiczna.22, 511–514 (2020).
Światowa Organizacja Zdrowia.Globalna częstość występowania i częstość występowania wybranych uleczalnych infekcji przenoszonych drogą płciową: przegląd i szacunki.Genewa: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM i in.Wiele formowanych pasków testowych 2D do pomiaru przepływu bocznego.Aplikacja ASS.Alma Mater.Inter Mediolan.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM i in.Całkowicie zamknięte urządzenie do analizy mikroprzepływowej na papierze.odbyt.Chemiczny.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. i in.Konkurencyjna immunochromatografia papierowa w połączeniu z elektrodami modyfikowanymi enzymami umożliwia bezprzewodowe monitorowanie i elektrochemiczne oznaczanie kotyniny w moczu.Czujniki 21, 1659 (2021).
Zhu, X. i in.Ilościowa ocena biomarkerów chorób za pomocą wszechstronnej, bocznej platformy płynów zintegrowanej z nanozymami, przy użyciu glukometru.czujnik biologiczny.Bioelektronika.126, 690–696 (2019).
Boo, S. i in.Pasek testowy ciążowy do wykrywania bakterii chorobotwórczych z wykorzystaniem konkanawaliny A-ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej-Cu3(PO4)2, hybrydowych nanokwiatów, separacji magnetycznej i odczytu ze smartfona.Mikrokomputer.Czasopismo.185, 464 (2018).